GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 检测标准

1.范围

本标准规定了食品中大肠菌群( Coliforms)计数的方法。

本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

2.术语和定义

2.1 大肠菌群 Coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.2 最可能数 Most probable number;MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

3.检验原理

3.1 MPN法

MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算岀待测样品中大肠菌群的最大可能数。

3.2平板计数法

大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。

4.设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：

4.1 恒温培养箱:36℃±1℃C。

4.2 冰箱:2℃～5℃

4.3 恒温水浴箱:46℃±1℃

4.4 天平:感量0.1g。

4.5 均质器。

4.6 振荡器。

4.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

4.8 无菌锥形瓶:容量500mL。

4.9 无菌培养皿:直径90mm。

4.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

4.11 菌落计数器。

5.培养基和试剂

5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose,LST)肉汤:见A.1。

5.2 煌绿乳糖胆盐( brilliant green lactose bile,BGLB)肉汤:见A.2。

5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂( violet red bile agar,VRBA):见A.3。

5.4 无菌磷酸盐缓冲液:见A.4。

5.5 无菌生理盐水:见A.5。

5.6 1mol/ L NaOh溶液:见A.6。

5.7 1mol/LHCl溶液:见A.7。

第一法大肠菌群MPN计数法

6.检验程序

大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

7.操作步骤

7.1 样品的稀释

7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质lmin~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。

7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1:10的样品匀液。

7.1.3 样品匀液的pH应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/ L Nah或1mol/LHCl调节。

7.1.4 用ⅠmL无菌吸管或微量移液器吸取Ⅰ:10样品匀液lmL,沿管壁缓缓注9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。

7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递増系列稀释样品勺液。每递増稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。

7.2 初发酵试验

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种ⅠmL(如接种量超过ⅠmL,则用双料LST肉汤),36℃士1℃培养24h土2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h士2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

7.3 复发酵试验(证实试验)

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物Ⅰ环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告

按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。

第二法大肠菌群平板计数法

8.检验程序

大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

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