1.范围
本标准规定了食品中副溶血性弧菌( Vibrio parahaemolyticus)的检验方法。
本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。
2.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱:36℃±1℃;
b) 冰箱:2℃～5℃、7℃～10℃;
c) 恒温水浴箱:36℃±1℃;
d) 均质器或无菌乳钵;
e) 天平:感量0.1g;
f) 无菌试管:18mm×180mm、15mm×100mm;
g )无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头;
h) 无菌锥形瓶:容量250mL、500mL、1000mL;
i) 无菌培养皿:直径90mm；
j) 全自动微生物生化鉴定系统；
k) 无菌手术剪、镊子；
3.培养基和试剂
3.1 3%氯化钠碱性蛋白胨水:见附录A中A.1。
3.2 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂:见附录A中A2。
3.3 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂:见附录A中A.3。
3.4 3%氯化钠三糖铁琼脂:见附录A中A4。
3.5 嗜盐性试验培养基:见附录A中A.5。
3.6 3%氯化钠甘露醇试验培养基:见附录A中A6。
3.7 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录A中A.7。
3.8 3%氯化钠MR-VP培养基:见附录A中A8。
3.9 3%氯化钠溶液:见附录A中A9。
3.10 我妻氏血琼脂:见附录A中A.10。
3.11 氧化酶试剂:见附录A中A.11。
3.12 革兰氏染色液:见附录A中A.12。
3.13 ONPG试剂:见附录A中A.13。
3.14 Voges-Proskauer(V-P)试剂:见附录A中A.14。
3.15 弧菌显色培养基。
3.16 生化鉴定试剂盒。
4.检验程序
副溶血性弧菌检验程序见图1。
5.操作步骤
5.1 样品制备
5.1.1 非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存,尽可能及早检验;冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻。
5.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物,包括贝肉和体液;甲壳类取整个动物,或者动物的中心部分,包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类,则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分,然后以无菌操作打开外壳,按上述要求取相应部分。
5.1.3 以无菌操作取样品25g(mL),加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL,用旋转刀片式均质器以8000r/min均质lmin,或拍击式均质器拍击2min,制备成1:10的样品匀液。如无均质器,则将样品放入无菌乳钵,225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵,样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶,再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1~2次,洗液放入锥形瓶,最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶,充分振荡,制备1:10的样品匀液。
5.2 增菌
5.2.1 定性检测
将5.13制备的1:10样品匀液于36℃±1℃培养8h～18h。
5.2.2 定量检测
5.2.2.1 用无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL,注入含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内,振摇试管混匀,制备1:100的样品匀液。
5.2.2.2 另取lm无菌吸管,按5.2.2.1操作程序,依次制备10倍系列稀释样品匀液,每递增稀释次,换用一支1mL无菌吸管。
5.2.2.3 根据对检样污染情况的估计,选择3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种3支含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管,每管接种1mL。置36℃±l℃恒温箱内,培养8h～18h。
5.3 分离
5.3.1 对所有显示生长的增菌液,用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液,于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36℃±1℃培养18h～24h。
5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落,用接种环轻触,有类似口香糖的质感,直径2mm~3mm。从培养箱取岀T℃BS平板后,应尽快(不超过lh)挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。
5.4 纯培养
挑取3个或以上可疑菌落,划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板,36℃±1℃培养18h～24h。
5.5 初步鉴定
5.5.1 氧化酶试验:挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验,副溶血性弧菌为氧化酶阳性。
5.5.2 涂片镜检:将可疑菌落凃片,进行革兰氏染色,镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性,呈棒状、弧状、卵圆状等多形态,无芽胞,有鞭毛。
5.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落,转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层,36℃C±1℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑,无气泡,斜面颜色不变或红色加深,有动力。
5.5.4 嗜盐性试验:挑取纯培养的单个可疑菌落,分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水,36℃±1℃培养24h,观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长,在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。
5.6 确定鉴定
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