1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定。
2.规范性引用性文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
第一法 高效液相色谱法
3.原理
试样经热水提取、酸性沉淀蛋白质后,以C18色谱柱分离,用紫外检测器定量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
4.2 盐酸。
4.3 氢氧化钠。
4.4 盐酸(2.4mol/L):准确移取10mL盐酸(4.2)于50mL容量瓶中,用水定容。
4.5 氢氧化钠溶液(2.5mol/L):称取5.0g氢氧化钠(4.3)于50mL容量瓶中,用水定容。
4.6 高氯酸(HClO4):体积分数为60%。
4.7 甲醇(CH4O):色谱纯。
4.8 异丙醇(C3H8O):色谱纯。
4.9 庚烷磺酸钠(C7H15NaO3S):优级纯。
4.10 标准溶液
4.10.1 烟酸及烟酰胺标准储备液(1.0mg/mL):称取烟酸及烟酰胺标准品各0.1g(精确到0.0001g,分别置于100mL容量瓶中,用水溶解定容。
4.10.2 烟酸及烟酰胺混合标准中间液(40μg/mL):分别准确吸取烟酸及烟酰胺标准储备液(4.10.1）2mL至50mL定量瓶中,用水定容。临用前配制。
4.10.3 烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液:分别准确吸取烟酸及烟酰胺混合标准中间液(4.10.2)0.0mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL,至50mL容量瓶中用水定容。该标准系列浓度分别为0.00μg/mL、0.80μg/mL、1.60μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL。临用前配制。
5.仪器和设备
5.1 高效液相色谱仪,带紫外检测器。
5.2 pH计:精度为0.01。
5.3 超声波振荡器。
5.4 天平:感量为0.1mg。
5.5 培养箱:30℃～80℃。
6.分析步骤
6.1 试样的预处理
6.1.1 含淀粉的试样:称取混合均匀固体试样约5.0g(精确到0.0001g)加入约25mL45℃～50℃的水,或称取混合均匀液体试样约20.0g(精确到0.0001g)于150mL锥形瓶中,再加入约0.5g淀粉酶(4.1),摇匀后向锥形瓶中充氮,盖上瓶塞,置于50℃～60℃的培养箱内培养约30min,取岀冷却至室温。
6.1.2 不含淀粉的试样:称取混合均匀固体试样约5.0g(精确到0.0001g)加入约25mL45℃～50℃的水,或称取混合均匀液体试样约20.0g(精确到0.0001g)于150mL锥形瓶中,振摇,静置5min～10min,充分溶解,并冷却至室温。
6.1.3 提取:将上述锥形瓶置于超声波振荡器中振荡约10min。
6.1.4 沉淀及定容:待试样溶液降至室温后,用盐酸(4.4)调节试样溶液的pH值至1.7±0.1,放置约2min后,再用氢氧化钠溶液(4.5)调节试样溶液的pH值至4.5±0.1。将试样溶液转至50mL容量瓶中,用水反复沖洗锥形瓶,洗液合并于50mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀后经滤纸过滤,滤液再经0.45μm微孔滤膜加压过滤,用试管收集,即为试样待测液。
6.2 参考色谱条件
色谱柱:C8柱(粒径5μm,150mm×4.6mm)或具有同等性能的色谱柱。
流动相:甲醇(4.7)70m,异丙醇(4.8)20mL,庚烷磺酸钠(4.9)1g,用9l0mL水溶解并混匀后,用高氯酸(4.6)调pH至2.1±0.1,经0.45μm膜过滤。
流速:10mL/min。
检测波长:261nm。
柱温:25℃。
进样量:10uL。
6.3 定量分析
6.3.1 标准曲线绘制
将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液(4.10.3)依次进行色谱测定(其标准样品色谱图参见附录A中图A.1.1)。记录各组分的色谱峰面积或峰髙,以峰面积或峰髙为纵坐标,以标准测定液的浓度为横坐标,绘制标准曲线。
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