SN/T 1196-2012 转基因成分检测 玉米检测方法 检测标准

1 范围

本标准规定了玉米及其加工产品中转基因成分检测的PCR方法和实时荧光PCR方法。

本标准的筛选检测适用于玉米及其加工产品中转基因成分的定性检测。

本标准的鉴定检测适用于玉米MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA2l、MON863、NK603TC507、MON88017、59122、MIR604、MIR162、DBT418、MON89034、LY038、ES3272、Bt10、DP98140品系转基因成分的定性检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义

GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求

GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法

3 术语、定义和缩略语

3.1 术语和定义

GB/T 19495.1 界定的以及下列术语和定义适用本文件。

3.1.1 转基因 transgene

将物种本身不具有的来源于其他物种的功能DNA序列，通各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品种特征。

3.1.2 内源基因 endogenous gene

在栽培的物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于对基因组中某一目的基因的定量分析。

3.2 缩略语

GB/T 19495.1 界定的以及下列缩略语适用于本文件。

CaMV35S:35 S promoter from Cauliflower moshic virus，来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子。

CDPK: calcium-dependent protein kinase(CDPK)gene，钙依赖蛋白激酶基因

CrylA(b): a synthetic gene encodes the first 648 amino acids， insecticidal-active truncated product identical to that of cryLA(b) gene of Bacillus thuringiensis subsp。苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cryIA(b)基因

CrygC： insecticidal-active truncated product identical to that of Cry 9C gene of Bacillus thuringiensis subsp，苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白Cry9C基因

Ct值：C： Cycle，t; threshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数

EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸

HSP70：0.8 Kb intron from the hsp70gene(heat- shock protein)，来自热休克蛋白(hsp70)基因的0.8Kb基因内区

IVR：invertase 1 gene from maize，玉米的转化酶1基因

IvS2：intron from the maize alcohol dehydrogenase gene，玉米乙醇脱氢酶基因的基因内区2

mEPSPS：maize5- enolypyruvylshikimate-3 phosphate synthase，来源于玉米的莽草酸羟基乙酰转移酶

NOS：terminator of nopaline synthase gene，胭脂碱合成酶基因终止子

NPTI：neomycin-3′- phosphotransferase gene，新霉素-3′-磷酸转移酶基因

OTP：optimized transit peptide gene，优化运输肽基因

P actin1：the promoter derived from the rice( Orya sativa) actin 1 gene，来源于玉米肌动蛋白1基因的启动子

PAT：phosphinothricin acetyltransferase gene，草丁膦乙酰转移酶基因

PCK：polymerase chain reaction，简称PCR

TE：Tris-HCl、EDTA缓冲液

Tris：tris( hydroxymethyl) aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷

Taq：Thermus aquatica，水生热栖菌

zein：玉米醇溶蛋白基因

4 防污染措施

检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2 中的规定执行。

5 抽样和制样

5.1 取样

按照GB/T 19495.7 中规定的方法执行。

5.2 制样

称取约50g玉米样品，经干热灭菌(150℃干热预处理2h)或120℃、30min高压消毒处理的碾钵或粉碎机中碾磨至样品粉末颗粒约0.5mm左右大小。

6 普通PCR方法

6.1 原理

样品经过提取DNA后，针对转基因植物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术特异性扩增外源基因的DNA片断，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有转基因成分。

6.2 试剂和材料

除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T 6682 规定的一级水。

6.2.1 引物：检测转基因玉米内、外源基因的引物及其信息见附录A。

6.2.2 Tag dna聚合酶。

6.2.3 dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP。

6.2.4 琼脂糖：电泳纯。

6.2.5 溴化乙锭(EB)或其他染色剂。

6.2.6 三氯甲烷

6.2.7 异戊醇。

6.2.8 异丙醇。

6.2.9 70%乙醇。

6.2.10 相对分子质量 Marker：50bp~300bp。

6.2.11 CTAB裂解液：3%(质量浓度)CTAB，1.4mol/LNaC，0.2%(体积分数)巯基乙醇，20mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH8.0

6.2.12 TE缓冲液：10mmol/ L Tris-HCl，pH8.0;1mmol/ L EDTA，pH8.0。

6.2.13 10×PCR缓冲液：100m mol/LKCl，160m mol/L(NH4)2SO4，20m mol/ L MgSO4，200m mol/LTris-HCl(pH 8.8)， 1%TritonX-100， 1 mg/mLBSA

6.2.14 5×TBE缓冲液：Tris54g，硼酸275g，0.5mol/ L EDTA(pH8.0)20mL，加蒸馏水至1000mL。

6.2.15 10×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。

6.2.16 RNA酶(10μg/mL)。

6.2.17 UNG酶( Uracil N-glycosylase)。

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