SN/T 3084.2-2014 进出口化妆品眼刺激性试验 角膜细胞试验方法 检测标准

1 范围

SN/T 3084 的本部分规定了化妆品眼刺激性角膜细胞试验方法。

本部分适用于化妆品原料和成品眼刺激性体外筛选试验。

本部分适用于部分化妆品使用的表面活性剂的筛选测试。

本部分可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一。可以结合其他眼刺激替代试验，对眼刺激效应进行综合评价。

本部分可作为其他领域眼刺激体外测试的参考方法。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件

SN/T 2285 化妆品体外替代试验实验室规范

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1 眼刺激性 eye irritation

眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。

3.2 SIRC细胞系 statens seruminstitut rabbit cornea cell line

来源于兔眼角膜组织的成纤维细胞系。

3.3 STE试验 short time exposure test

采用SIRC细胞进行的短时间暴露试验，本部分指5min暴露试验。

4 原理

本试验采用来源于眼刺激靶器官的SIRC细胞系，将样本干预细胞5min，然后去除。采用CCK-8细胞毒性测试法( cell counting kit-8 cytotoxicity test)，使干预后的细胞与CCK-8试剂反应，活细胞线粒体中的脱氢酶会将CCK-8试剂还原成橙黄色的甲臢染料，活细胞越多，被还原成的染料越多，颜色深浅与细胞数目呈线性关系。通过测定波长450nm时的吸光度值，计算细胞的生存率，判断样品的眼刺激性。本部分为STE短时暴露试验，适用于不同溶解性状的样本。

5 仪器与试剂耗材

5.1 仪器

5.1.1 Ⅱ级生物安全柜。

5.1.2 二氧化碳培养箱：温度37℃±1℃，湿度90%±5%，5%±1%CO2浓度。

5.1.3 恒温水浴箱：温度37℃±1℃。

5.1.4 倒置显微镜。

5.1.5 酶标仪。

5.1.6 电子大平：0.1mg量程。

5.1.7 细胞计数仪或血球计数器。

5.1.8 离心机。

5.1.9 混悬仪。

5.1.10 真空吸液泵。

5.1.11 程序降温仪。

5.1.12 液氮罐。

5.1.13 5μL~50μL，10μL~100μL，20μL~200μL量程排枪。

5.1.14 细胞冻存盒。

5.2 试剂耗材

5.2.1 MEM培养基( minimum essential medium)

5.2.2 胎牛血清(FBS)：56℃加热灭30min。

5.2.3 0.25%胰酶/EDTA溶液(Trypsin/EDTA)：0.25%胰酶溶液与0.02 mol/L EDTA溶液1：1混均。

5.2.4 青霉素/链霉素双抗：工作溶液青霉素(100U/mL链霉素(100μg/mL)。

5.2.5 MEM完全培养基：含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL霉素。

5.2.6 二甲基亚砜(DMSO)。

5.2.7 细胞冻存培养基：含20%FBS、10%DMSO的MEM培养基。

5.2.8 磷酸盐缓冲液(PBS)。

5.2.9 矿物油：细胞培养级。

5.2.10 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)：称取0.01gSDS于10mL无菌试管中，加入PBS至10mL。

5.2.11 5%吐温20(TWEEN20)：称取0.5 g TWEEN20于10mL无菌试管中，加入PBS至10mL。

5.2.12 CCK-8试剂。

5.2.13 50mL无菌离心管。

5.2.14 无菌吸管(5mL，10mL)。

5.2.15 10mL无菌试管。

5.2.16 细胞培养瓶及培养板：25cm²、75cm²培养瓶：96孔平底细胞培养板。

6 试验方法

6.1 基本要求

试验过程应符合SN/T 2285 的要求。为保证溯源性，SIRC细胞应由有资质的细胞库提供，选择0代之内的细胞进行试验。所有细胞培养相关操作步骤都应在Ⅱ级生物安全柜里进行，确保无菌操作。

6.2 细胞培养

6.2.1 SIRC细胞培养

购置的SIRC细胞，更换MEM完全培养基，在37℃±1℃，湿度90%±5%，CO2浓度5.0%±1%条件下进行培养(后续试验细胞培养均按此条件)。

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