1 范围
本标准规定了进出口粮谷中桔霉素含量液相色谱检测方法。
本标准适用于进出口大米、大麦、燕麦、小麦中桔霉素含量的检测。
2 方法提要
用乙腈-异丙醇水的混合溶液提取试样中桔霉素，C18固相萃取小柱净化，用配荧光检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。
3 试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相当纯度的水。
3.1 异丙醇：色谱纯。
3.2 乙腈：色谱纯。
3.3 磷酸：优级纯。
3.4 提取溶剂：乙腈-异丙醇-水(35+10+55，体积比)，用磷酸调pH为1.5。
3.5 磷酸溶液：取5.6mL磷酸，以水定容至1000mL。
3.6 流动相：乙腈-异丙醇-0.08mol/L磷酸(35+10+55，体积比)。
3.7 C18固相萃取柱：500mg，3mL，或相当者。使用前分别用5mL甲醇和5mL水预淋洗并保持柱体湿润。
3.8 桔霉素标准物质(citrinin，Cl3H14O3，CAS编号：518-75-2)：纯度大于等于97%。
3.9 桔霉素标准储备液：称取适量桔霉素标准物质，用乙腈溶解并定容至1.0mg/mL，O℃~4℃保存。
3.10 桔霉素标准工作液：根据需要用流动相将标准储备液稀释成25ng/mL、50ng/mL、1O0ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的标准工作溶液。
3.11 玻璃纤维滤纸：直径1lcm，孔径1.5μm。
4 仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪：配有荧光检测器。
4.2 振荡器。
4.3 离心机：4000r/min。
4.4 真空固相萃取装置。
4.5 氮吹仪。
4.6 分析天平。
5 试样制备和保存
取有代表性样品500g，用粉碎机粉碎并通过830μm圆孔筛，混匀，分成两份，装入洁净容器内，密封并标识。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
6 测定步骤
6.1提取
称取试样约5g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加10ml提取溶剂(3.4)，在振荡器上振荡提取30min。于3500r/min离心4min，上清液转入另一离心管中。在残渣中再加入5mL提取溶剂(3.4)，重复上述操作，合并上清液。在提取液中加水至4omL，并用磷酸调pH为1.5，过玻璃纤维滤纸(3.11)，待净化。
6.2 净化
将上述溶液过预淋洗好的C18固相萃取柱，用5mL水淋洗柱子。待淋洗液全部流岀柱子后，减压抽干3min。用l0ml甲醇以1.0mL/min的速度洗脱，收集全部洗脱液，在40℃下，N2吹干，再以1.0mL流动相溶解，过0.2μm滤膜，供液相色谱测定。
6.3 测定
6.3.1 液相色谱条件
a) 色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒径5μm，或相当者；
b) 流动相：乙腈-异丙醇-0.08mol/L磷酸(35+10+55，体积比)；
c) 流速：1.0mL/min；
d) 进样量：50μL；
e) 柱温：28℃；
f) 检测波长：Ex=331nm，Em=500nm。
6.3.2 色谱测定
根据样液中被测桔霉素含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作液和样液中桔霉素响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，桔霉素保留时间约为9.1min，标准物质色谱图参见附录A中图A.1。
6.3.3 空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
7 结果计算和表述
用色谱数据处理软件或按式(1)计算试样中桔霉素含量，计算结果需将空白值扣除：
式中：
X——试样中桔霉素含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
A——样液中桔霉素的峰面积；
As——标准工作液中桔霉素的峰面积；
c——标准工作液中桔霉素的浓度，单位为微克每毫升(g/mL)
V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；
m-——最终样液所代表的试样量，单位为克(g)。
8 测定低限、回收率
8.1 测定低限
本方法的测定低限为0.01mg/kg。
8.2 回收率
粮谷中桔霉素检测的添加回收率数据见表1。
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