1.范围
GB/T 18932的本部分规定了蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱测定方法。
本部分适用于蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。
本部分的方法检出限:土霉素、四环素、金霉素、强力霉素均为0.010mg/kg。
2.规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T 18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。
GB/T 6379-1986 测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(neq ISO 5725:1981)
GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696:1987)
3.原理
试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/LNa2 EDTA-Mcllvaine(pH=4.0±0.05)缓冲溶液提取,经离心后,上清液用 Oasis hLB或相当的固相萃取柱和阴离子交换柱净化,紫外检测器高效液相色谱仪测定,外标法定量。
4.试剂和材料
除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682-1992规定的一级水。
4.1 甲醇:一级色谱纯。
4.2 乙腈:一级色谱纯。
4.3 乙酸乙酯:重蒸馏。
4.4 磷酸氢二钠(Na2HPO·2H2O):优级纯。
4.5 柠檬酸(C6H8O7·H2O)。
4.6 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)。
4.7 草酸
4.8 磷酸氢二钠溶液:0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠(4,4),用水溶解,定容至1000mL。
4.9 柠檬酸溶液:0.1mo/L。称取21.01g柠檬酸(4.5),用水溶解,定容至1000mL。
4.10 Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.lmol/L柠檬酸溶液(4.9)与625mL0.1mol/L磷酸氢二钠溶液(4.8)混合,必要时用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH=4.0±0.05。
4.11 Na2EDTA- Mcllvaine缓冲溶液:0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠(4.6)放入1625 mL Mcllvaine缓冲溶液(4.10)中,使其溶解,摇匀。
4.12 甲醇十水(1+19):量取5mL甲醇(4.1)与95mL水混合。
4.13 Oasis HLB固相萃取柱或相当者:500mg,6mL。使用前分别用5m甲醇和10mL水预处理,保持柱体湿润。
4.14 阴离子交换柱:羧酸型,500mg,3mL。使用前用5mL乙酸乙酯预处理,保持柱体湿润。
4.15 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质:纯度≥95%。
4.16 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准溶液:0.1mg/mL。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质(4.15),分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液贮存在-18℃。
根据需要用流动相逐级稀释成适当浓度的混合标准工作溶液,混合标准工作溶液在4℃保存,可使用3天。
5.仪器
5.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。
5.2 分析天平:感量0.1mg,0.01g。
5.3 液体混匀器。
5.4 固相萃取真空装置。
5.5 贮液器:50mL。
5.6 微量注射器:25μL,100μL。
5.7 刻度样品管:5mL,精度为0.1mL。
5.8 真空泵:真空度应达到80kPa。
5.9 离心管:50mL。
5.10 平底烧瓶:100mL。
5.11 pH计测量精度±0.02。
6.试样的制备与保存
6.1 试样的制备
对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60℃的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中,密封,并标明标记。
6.2 试样保存
将试样于常温下保存。
7.测定步骤
7.1 提取
称取6g试样,精确到0.01g。置于150mL三角瓶中,加入30mNa2 EDTA-Mcllvalne缓冲溶液(4.11),于液体混匀器上快速混合1min,使试样完全溶解。样液倒入50mL离心管中,以3000r/min离心5min,待净化。
7.2 净化
将上清液(7.1)倒入下接 Oasis HLB柱或相当者(4.13)的贮液器中,上清液以≤3mL/min的流速通过Oass或相当的固相萃取柱,待上清液完全流出后,用5mL甲醇十水(4.12)洗柱,弃去全部流出液。在65kPa的负压下,减压抽干20min,最后用15mL乙酸乙酯(4.3)洗脱收集洗脱液于100mL圆底烧瓶中。
按上述方法使洗脱液(7.2)在减压情况下以≤3mL/min的流速通过阴离子交换柱(4.14),待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇(4.1)洗柱，弃去全部流出液。在65kPa负压下，减压抽干5min，再用4mL流动相洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，供液相色谱仪测定。
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