NY/T 1756-2009 饲料中孔雀石绿的测定 检测标准

1 范围

本标准规定了用液相色谱伩和液相色谱-串联质谱仪测定饲料中的孔雀石绿及其同系物无色孔雀石绿含量的方法。

本标准分为高效液相色谱法和髙效液相色谱串联质谱法，髙效液相色谱-串联质谱法为确证法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。

液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为l0μg/kg；液相色谱-串联质谱法的定量限均为1.0μg/kg。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 14699.1 饲料采样

GB/T 20195 动物饲料试样的制备

3 采样

按GB/T 14699.1 执行。

4 试样的制备

选取有代表性饲料样品，按GB/T 20195 制备样品，过0.28mm孔筛。

5 液相色谱法

5.1 原理

以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取，再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。

5.2 试剂

除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682 规定的一级用水。

5.2.1 孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95%。

5.2.2 无色孔雀石绿标准品：纯度≥95%。

5.2.3 乙腈：色谱纯。

5.2.4 二氯甲烷。

5.2.5 盐酸羟胺溶液：称取12.5g盐酸羟胺溶于50mL水中。

5.2.6 乙酸钠缓冲溶液：称取4.95g无水乙酸钠和0.95g对甲苯磺酸于900ml水中，用冰乙酸调节pH45，用水定容至100mL。

5.2.7 1.0mol/L对甲苯磺酸溶液：称取17.2g对甲苯磺酸，加水溶解并定容至100mL。

5.2.8 酸性氧化铝，粒度为0.071nm~0.1501nm，层析用。

5.2.9 乙腈-乙酸钠缓冲溶液：乙腈十乙酸钠=60+40(V+V)。

5.2.10 氯化钠溶液：称取25g氯化钠，加水溶解并定容至500mL。

5.2.11 孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取孔雀石绿草酸盐(5.2.1)O.l000g，用乙腈溶解，定容至100 ml。该溶液中孔雀石绿的浓度为1mg/mL，于-18℃保存可使用3个月。

5.2.12 无色孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取无色孔雀石绿(5.2.2)0.1000g，用乙腈溶解，定容至100mL，该溶液中无色孔雀石绿浓度为lmg/mL，于-18℃保存可使用3个月。

5.2.13 孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液：精确移取孔雀石绿标准贮备溶液(5.2.11)和无色孔雀石绿标准贮备溶液(5.2.12)各0.5mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为10g/mL，于2℃~8℃保存可使用1个月。

5.2.14 孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液：精确移取孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液(5.2.13)lmL，置于l00mL棕色容量瓶中，用乙腈乙酸钠缓冲溶浟(5.2.9)定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为100mg/mL，于分析前配制使用。

5.2.15 盐酸羟胺甲醇溶液：取lm盐酸羟胺溶液(5.2.4)，加甲醇定容至100mL。

5.3 仪器

5.3.1 高效液相色谱仪：配紫外可见光检测器。

5.3.2 电子天平：感量0.001g、感量0.001g。

5.3.3 离心机，转速4000r/min。

5.3.4 振荡器。

5.3.5 旋转蒸发器，可控温25℃~40℃。

5.3.6 固相萃取柱：丙基磺酸阳离子树脂PRS( propylsulfonic acid)柱：200mg/5mL~500mg/5mL中性氧化铝柱：500mg/6mL~1000mg/6mL

5.3.7 色谱柱：氰基柱(粒度为5μm)，柱长250mm、内径4.6mm。

5.3.8 二氧化铅柱：柱长35mm、内径46mm。

5.4 分析步骤

5.4.1 提取

称取饲料样品约5g(精确到0.001lg)，置于100mL离心管中，依次加入1.5mL盐酸羟胺溶液(5.2.5)、2mL对甲苯磺酸溶液(5.2.7)、5mL乙酸钠缓冲溶液(5.2.6）和20mL乙腈，加入约2g酸性氧化铝(5.2.8)，振荡2min，超声30min，4000r/min离心5min。将上清液转移至250mL分液漏斗中，向离心管中再次加入20mL乙腈，振摇2min，4000r/min离心5min，合并上清液至分液漏斗中。

5.4.2 液液萃取

加入50mL氯化钠溶液(5.2.10)、50mL二氯甲烷(5.2.4)，旋摇，静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入2mL二氯甲烷，旋摇，静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35℃下减压旋转蒸发(注意：开始时温度不要直接升到35℃，以免爆沸)至近干，加入5mL乙腈溶解残渣，备用。

5.4.3 净化

5.4.3.1 固相萃取柱的活化

按中性氧化铝柱在上、PRS柱在下的顺序将两柱串联，使用前用5mL乙腈预洗两柱。

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